прадукты

Новы высокаэфектыўны аналіз вадкаснай храматаграфіі для глікозілтрансфераз, заснаваны на дэрыватызацыі антранілавай кіслатой і флуарэсцэнтным выяўленні.

Аналізы былі распрацаваны з выкарыстаннем унікальнай хіміі маркіроўкі 2-амінабензойнай кіслаты (2AA; антранілавая кіслата, AA) для вымярэння актыўнасці β1-4 галактазілтрансферазы (GalT-1) і α2-6 сіялілтрансферазы (ST-6) з дапамогай высокаэфектыўнай вадкасці. храматаграфія (ВЭЖХ) з флуарэсцэнтным выяўленнем (Anumula KR. 2006. Дасягненні метадаў флуарэсцэнтнай дэрыватызацыі для высокаэфектыўнага вадкаснага храматаграфічнага аналізу вугляводаў глікапратэінаў. Anal Biochem. 350:1-23).N-ацэтылглюкозамін (GlcNAc) і N-ацэтылактозамін выкарыстоўваліся ў якасці акцэптараў, а урыдзін-дыфасфат (UDP) -галактоза і цитидинмонофосфат (CMP) -N-ацэтылнейраміновая кіслата (NANA) у якасці донараў для GalT-1 і ST-6 адпаведна.Ферментатыўныя прадукты пазначалі in situ AA і аддзялялі ад субстратаў на калонцы TSKgel Amide 80 з выкарыстаннем умоў нармальнай фазы.Ферментныя адзінкі вызначалі па плошчах пікаў у параўнанні з адначасова дэрыватызаванымі стандартамі Gal-β1-4GlcNAc і NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Былі ўстаноўлены лінейнасць (час і канцэнтрацыя фермента), дакладнасць (унутры- і інтэраналіз) і ўзнаўляльнасць аналізаў.Аналізы апынуліся карыснымі для маніторынгу актыўнасці ферментаў падчас выдзялення і ачысткі.Аналізы былі вельмі адчувальнымі і выконваліся роўнымі або лепшымі, чым традыцыйныя вымярэнні на аснове радыеактыўнага цукру.Фармат аналізу таксама можна выкарыстоўваць для вымярэння актыўнасці іншых трансфераз пры ўмове, што акцэптары вугляводаў утрымліваюць аднаўленчы канец для маркіроўкі.Аналіз на акцэптары глікапратэіна быў распрацаваны з выкарыстаннем IgG.Быў распрацаваны кароткі метад прафілявання ВЭЖХ для падзелу гліканаў IgG (біянтэнарных G0, G1, G2, мона- і дысіяліраваных), які спрыяў хуткаму вызначэнню актыўнасці GalT-1 і ST-6.Акрамя таго, гэты метад прафілявання павінен апынуцца карысным для маніторынгу змяненняў гліканаў IgG у клінічных умовах.