навіны

IPTG (ізапрапіл-β-D-тиогалактозид) з'яўляецца аналагам субстрата β-галактозидазы, які адрозніваецца высокай индуцируемостью.Пры індукцыі IPTG індуктар можа ўтвараць комплекс з бялком-рэпрэсарам, так што канфармацыя бялку-рэпрэсара змяняецца, так што ён не можа спалучацца з генам-мішэнню, і ген-мішэнь эфектыўна экспрэсуецца.Такім чынам, як павінна быць вызначана канцэнтрацыя IPTG падчас эксперыменту?Чым больш, тым лепш?
Спачатку давайце разбярэмся ў прынцыпе індукцыі IPTG: лактозны оперон (элемент) E. coli змяшчае тры структурныя гены, Z, Y і A, якія кадуюць β-галактозідазу, пермеазу і ацэтылтрансферазу адпаведна.lacZ гідролізуе лактозу ў глюкозу і галактозу або ў алалактозу;lacY дазваляе лактозе ў навакольным асяроддзі праходзіць праз клеткавую мембрану і трапляць у клетку;lacA пераносіць ацэтыльную групу ад ацэтыл-КоА да β-галактозіду, што прадугледжвае ліквідацыю таксічнага эфекту.Акрамя таго, існуе аперацыйная паслядоўнасць O, пачатковая паслядоўнасць P і рэгулятарны ген I. Код гена I - гэта бялок-рэпрэсар, які можа звязвацца з пазіцыяй O паслядоўнасці аператара, так што оперон (мета) падаўляецца і выключаны.Існуе таксама сайт звязвання для катабалічнага гена актыватара бялку-CAP сайт звязвання перад ініцыятыўнай паслядоўнасцю P. Паслядоўнасць P, паслядоўнасць O і сайт звязвання CAP разам складаюць рэгулятарную вобласць lac-оперона.Кадавальныя гены трох ферментаў рэгулююцца адной і той жа рэгулятарнай вобласцю для дасягнення скаардынаванай экспрэсіі генных прадуктаў.

Пры адсутнасці лактозы лак-оперон (мета) знаходзіцца ў стане падаўлення.У гэты час lac-репрессор, экспрессируемый паслядоўнасцю I пад кантролем паслядоўнасці промотора PI, звязваецца з паслядоўнасцю O, што прадухіляе звязванне РНК-палімеразы з паслядоўнасцю P і інгібіруе ініцыяцыю транскрыпцыі;калі лактоза прысутнічае, lac-оперон (мета) можа быць індукаваны. У гэтай сістэме оперон (мета) сапраўдным індуктарам з'яўляецца не сама лактоза.Лактоза трапляе ў клетку і каталізуецца β-галактозидазой для пераўтварэння ў алалактозу.Апошні, як малекула-індуктар, звязваецца з бялком-рэпрэсарам і змяняе канфармацыю бялку, што прыводзіць да адрыву бялку-рэпрэсара ад паслядоўнасці О і транскрыпцыі.Изопропилтиогалактозид (ИПТГ) аказвае тое ж дзеянне, што і аллолактоза.Гэта вельмі магутны індуктар, які не метаболізіруется бактэрыямі і вельмі стабільны, таму яго шырока выкарыстоўваюць у лабараторыях.

Як вызначыць аптымальную канцэнтрацыю ИПТГ?Возьмем у якасці прыкладу кішачную палачку.
Генна-інжынерны штам E. coli BL21, які змяшчае станоўчы рэкамбінантны pGEX (CGRP/msCT), быў засеяны ў вадкае асяроддзе LB, якое змяшчае 50 мкг·мл-1 Amp, і культываваўся на працягу ночы пры 37°C.Вышэйпаказаная культура была засеяна ў 10 бутэлек са свежай вадкай асяроддзем LB аб'ёмам 50 мл, якая змяшчае 50 мкг·мл-1 ампер у суадносінах 1:100 для экспансійнай культуры, і калі значэнне OD600 было 0,6~0,8, да канчатковай канцэнтрацыі быў дададзены IPTG.Гэта 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммоль·л-1.Пасля індукцыі пры той жа тэмпературы і ў той жа час з яго бралі 1 мл бактэрыяльнага раствора, бактэрыяльныя клеткі збіралі цэнтрыфугаваннем і падвяргалі SDS-PAGE для аналізу ўплыву розных канцэнтрацый IPTG на экспрэсію бялку, а затым выбраць канцэнтрацыю IPTG з найбольшай экспрэсіяй бялку.
Пасля эксперыментаў выявіцца, што канцэнтрацыя IPTG не настолькі вялікая, наколькі гэта магчыма.Гэта таму, што IPTG валодае пэўнай таксічнасцю для бактэрый.Перавышэнне канцэнтрацыі таксама заб'е клетку;і ўвогуле кажучы, мы спадзяемся, што чым больш растваральнага бялку экспрессируется ў клетцы, тым лепш, але ў многіх выпадках, калі канцэнтрацыя IPTG занадта высокая, утворыцца вялікая колькасць уключэнняў.Цела, але колькасць растваральнага бялку знізілася.Такім чынам, найбольш прыдатная канцэнтрацыя IPTG часта бывае не чым больш, тым лепш, а чым ніжэй канцэнтрацыя.
Мэтай індукцыі і культывавання генна-інжынерных штамаў з'яўляецца павелічэнне выхаду мэтавага бялку і зніжэнне выдаткаў.На экспрэсію гена-мішэні ўплываюць не толькі ўласныя фактары штаму і плазміда экспрэсіі, але і іншыя знешнія ўмовы, такія як канцэнтрацыя індуктара, тэмпература індукцыі і час індукцыі.Такім чынам, у цэлым перад экспрэсіяй і ачысткай невядомага бялку лепш за ўсё вывучыць час індукцыі, тэмпературу і канцэнтрацыю IPTG, каб выбраць прыдатныя ўмовы і атрымаць найлепшыя эксперыментальныя вынікі.